我校生命學(xué)院馬涵慧教授課題組與麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院Thoru Pederson教授合作開(kāi)發(fā)了新型的活細(xì)胞 DNA標(biāo)記系統(tǒng)“CRISPR-Sirius”。 北京時(shí)間2018年10月31日，相關(guān)成果以“CRISPR-Sirius: RNA scaffolds for signal amplification in genome imaging”為題，在知名學(xué)術(shù)期刊《自然-方法》（Nature Methods）上在線(xiàn)發(fā)表。CRISPR-Sirius極大地提高了在活細(xì)胞中跟蹤DNA的靈敏度和多樣性。為研究3D基因組動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)如何在時(shí)間維度上變化（4D）、如何影響基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控、如何決定細(xì)胞的命運(yùn)奠定了很好的基礎(chǔ)。

人類(lèi)基因組含有約30億個(gè)DNA堿基對(duì)，細(xì)胞里的基因組DNA大約為2米長(zhǎng)，而細(xì)胞核的大小一般在10-20微米左右。染色體是如何高度折疊成3D結(jié)構(gòu)并動(dòng)態(tài)地調(diào)控基因表達(dá)一直是研究熱點(diǎn)。染色體構(gòu)象捕獲（Hi-C，Dekker J et al., Science2002）和高通量DNA原位雜交（MERFISH, Wang S et al., Science2016）等技術(shù)正在被廣泛地應(yīng)用到3D基因組研究中，但這些技術(shù)主要應(yīng)用在固定細(xì)胞中，解決的是靜態(tài)的基因組3D結(jié)構(gòu)。為了研究 4D（ 第4維度為時(shí)間）基因組動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)和功能， CRISPR 技術(shù)被改造成用在活細(xì)胞中示蹤序列特異的基因組DNA（Chen et al.,Cell2013），然而在單細(xì)胞中示蹤不同的DNA元件以及DNA-DNA相互作用（比如增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的動(dòng)態(tài)變化等）仍然相當(dāng)困難。

馬涵慧教授早期利用CRIPSR Cas9的同源蛋白開(kāi)發(fā)了活細(xì)胞DNA標(biāo)記的三色系統(tǒng)，成功在單細(xì)胞中標(biāo)記了多個(gè)染色體 （Ma H et al., PNAS2015）。2016年，他又進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了CRISPRainbow技術(shù)（Ma H et al., Nat. Biotechnol. 2016），能夠在活細(xì)胞里同時(shí)跟蹤6個(gè)不同染色體。然而以上基于CRISPR的DNA標(biāo)記系統(tǒng)由于不夠靈敏，極大的限制了其在生物學(xué)研究中的應(yīng)用。

馬涵慧教授早期利用CRISPR-Broccoli系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)CRISPR guide RNA在活細(xì)胞中的穩(wěn)定性直接決定了CRISPR 標(biāo)記或編輯的效率 （Ma H et al., J. Cell Biol. 2016）。在這項(xiàng)最新的研究中，馬涵慧課題組再次利用CRISPR-Broccoli系統(tǒng)在活細(xì)胞中直接觀(guān)察了不同位置的改造對(duì)guide RNA穩(wěn)定性的影響（下圖a & b），發(fā)現(xiàn)外源RNA插入到 tetraloop比3'-末端要穩(wěn)定很多 。馬涵慧課題組進(jìn)一步和中佛羅里達(dá)大學(xué)的張少杰課題組合作，通過(guò)計(jì)算的方法尋找到了最穩(wěn)定的RNA結(jié)構(gòu)，成功地設(shè)計(jì)CRISPR-Sirius（下圖c & d）。優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)大大提高了基于CRISPR標(biāo)記的靈敏度，可以用來(lái)同時(shí)標(biāo)記一個(gè)染色體上多個(gè)位點(diǎn)。文章最后利用CRISPR-Sirius示蹤同一條染色體上從幾千個(gè)堿基（kbs）到幾兆個(gè)堿基（Mbs）距離的不同位點(diǎn)，以人19號(hào)染色體為例子測(cè)量了染色體多個(gè)位點(diǎn)之間的空間距離以及它們?cè)诓煌憝h(huán)境下的運(yùn)動(dòng)軌跡。這項(xiàng)新技術(shù)為基因組的4D結(jié)構(gòu)和功能研究提供一個(gè)全新的平臺(tái)。

本論文是由上海科技大學(xué)，美國(guó)麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院和中佛羅里達(dá)大學(xué)共同完成，馬涵慧教授為第一作者和唯一的通訊作者。

論文鏈接:https://www.nature.com/articles/s41592-018-0174-0

a. CRISPR-Broccoli系統(tǒng)的構(gòu)建；b. 利用CRISPR-Broccoli活細(xì)胞檢測(cè)CRISPR guideRNA的穩(wěn)定性；

c.CRISPR-Sirius系統(tǒng)示意圖；d.利用CRISPR-Sirius活細(xì)胞跟蹤染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)。