近日，上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所楊貝/Wilson研究團(tuán)隊(duì)與復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院陸路/姜世勃研究團(tuán)隊(duì)通力合作，通過(guò)交叉運(yùn)用多種不同的技術(shù)手段，研發(fā)出能夠廣譜抑制多種人冠狀病毒（HCoV）感染的多肽類(lèi)融合抑制劑EK1，并揭示了其作用靶點(diǎn)和發(fā)揮功能的分子機(jī)制。該研究同時(shí)證明了冠狀病毒（CoV）刺突蛋白的HR1區(qū)域是一個(gè)重要且保守的藥物作用靶點(diǎn)，為后續(xù)抗HCoVs的廣譜藥物研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和重要思路。目前該研究成果以“A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike”為題在線(xiàn)發(fā)表于Science子刊《科學(xué)進(jìn)展》上（Science Advances）。

近年來(lái)，嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）等高致病性HCoVs的出現(xiàn)不斷威脅著人類(lèi)的生命健康，影響了社會(huì)的穩(wěn)定發(fā)展。但是目前尚無(wú)獲得批準(zhǔn)的防治SARS-CoV和MERS-CoV感染的疫苗和藥物在臨床中應(yīng)用。更須關(guān)注的是，自然界中廣泛存在的其他CoVs，也可能與SARS-CoV和MERS-CoV相類(lèi)似，即通過(guò)跨種傳播感染人類(lèi)。近期，世界衛(wèi)生組織（WHO）提出要防御“Disease X”,即由目前未知的病原體（包括新型冠狀病毒）引起的嚴(yán)重國(guó)際大流行的人類(lèi)疾病（http://www.who.int/blueprint/priority-diseases/en/）。因此，探尋在各種HCoV上均保守的藥物靶點(diǎn)，以及基于這些靶點(diǎn)研發(fā)廣譜、高效的抗HCoV藥物成為該領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。該類(lèi)研究也將為目前流行的HCoV的防治和未來(lái)可能出現(xiàn)的新型HCoV的防控提供解決方案和技術(shù)儲(chǔ)備。

復(fù)旦大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表于2014年《自然通訊》（Lu L et al., Nature Communications5:3067, 2014）的前期相關(guān)工作中成功研發(fā)了源自于MERS-CoV S蛋白上HR2區(qū)域的多肽類(lèi)融合抑制劑MERS-HR2P。該多肽可作用于MERS-CoV S蛋白的HR1區(qū)域，抑制其形成α-六螺旋結(jié)構(gòu)，從而阻止MERS-CoV通過(guò)病毒-宿主膜融合進(jìn)入靶細(xì)胞。然而，盡管MERS-CoV和SARS-CoV同屬β類(lèi)HCoVs，多肽MERS-HR2P卻并不能有效抑制SARS-CoV的感染。同樣，源自于SARS-CoV HR2的多肽也無(wú)法有效地抑制MERS-CoV的感染。此外，上海科技大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)已發(fā)表的前期工作同樣揭示與β類(lèi)HCoVs相比，α類(lèi)HCoVs（如HCoV-229E）的HR1區(qū)域要長(zhǎng)出14個(gè)氨基酸并表現(xiàn)出不同的表面電荷分布特征(Yan L et al., Acta Crystallogr D Struct Biol.74:841-51,2018)。這些現(xiàn)象進(jìn)一步增加了不同HCoVs間HR1區(qū)域的差異。因此，各種HCoV的HR1區(qū)域是否具有足夠的保守性以支撐廣譜抗HCoV融合抑制劑的研發(fā)在領(lǐng)域內(nèi)一直存在爭(zhēng)議。

為解決該關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)建立了多個(gè)HCoVs 的S蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞膜融合系統(tǒng)，并通過(guò)交叉篩選的方式，發(fā)現(xiàn)了源自HCoV-OC43 HR2區(qū)域的多肽（OC43-HR2P）具有廣譜抗HCoV的活性。在此基礎(chǔ)上，團(tuán)隊(duì)成員以O(shè)C43-HR2P為模板，進(jìn)一步優(yōu)化序列，從而獲得一條溶解度更好、抑制活性更高的多肽EK1。多肽EK1在α類(lèi)HCoVs 和β類(lèi)HCoVs的假病毒和活病毒感染系統(tǒng)上均展示出廣譜且高效的抗病毒活性（如Figure1所示）。

聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步解析了多肽EK1與分別來(lái)源于α和β類(lèi)等多個(gè)不同HCoVs的HR1的共晶結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果顯示EK1可通過(guò)大量保守而又廣泛的疏水及親水相互作用與不同HCoVs的HR1區(qū)域結(jié)合（如Figure2所示）。研究還發(fā)現(xiàn)EK1多肽在與不同長(zhǎng)度、不同理化特征的HR1s發(fā)生相互作用時(shí)具有很好的構(gòu)象可塑性與表面電荷包容性，其不僅可以很好地作用于β類(lèi)HCoV的HR1區(qū)域，而且可以通過(guò)良好的可塑性與包容性充分保障其與α-HCoV的長(zhǎng)HR1區(qū)域之間的相互作用。這些結(jié)果不僅從結(jié)構(gòu)上揭示了多肽EK1廣譜、高效抑制不同HCoVs感染的分子機(jī)制，同時(shí)也證明了HR1s在功能和結(jié)構(gòu)上具有獨(dú)特的保守性，可成為研發(fā)廣譜抗HCoVs藥物的重要靶點(diǎn)。

基于上述研究，聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開(kāi)展了EK1多肽在動(dòng)物體內(nèi)抗病毒活性的研究。結(jié)果顯示，EK1在代表性病毒HCoV-OC43和MERS-CoV感染的小鼠模型上均展示出較好的體內(nèi)抗病毒效果，并且該多肽在體內(nèi)具有較好的安全性和和較低的免疫原性，顯示其具有良好的應(yīng)用前景，具備被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為用于防治目前流行的多種HCoVs和應(yīng)對(duì)未來(lái)可能出現(xiàn)的新型HCoVs的特異性藥物的潛力。

上?？萍即髮W(xué)博士研究生嚴(yán)磊和復(fù)旦大學(xué)博士后夏帥、徐巍為本文的共同第一作者，上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所Co-PI楊貝和Ian A.Wilson教授、復(fù)旦大學(xué)陸路研究員和姜世勃教授為本文的共同通訊作者。本研究在上?？萍即髮W(xué)與復(fù)旦大學(xué)等兄弟院校的通力合作下完成，并得到了中國(guó)疾病預(yù)防控制中心譚文杰教授、美國(guó)德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部Chien-Te K.Tseng教授等學(xué)者的大力支持與幫助；受到了來(lái)自于國(guó)家十三五傳染病重大專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目等基金的資助。

文章鏈接：https://advances.sciencemag.org/content/5/4/eaav4580

Figure 1. The potent and broad-spectrum antiviral activity of EK1. A. The antiviral mechanism of HR2P peptides. B. The sequences of the designed peptides: HR1Ps, HR2Ps and EK1. C. Inhibitory activity of EK1 in cell-cell fusion mediated by the various CoV S proteins. D. Inhibitory activity of EK1 against pseudotyped CoVs infection. E. Inhibitory activity of EK1 on live HCoV replication for MERS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-229E and HCoV-NL63, respectively.

Figure 2. Structural Studies of EK1 in complex with the HR1 regions from MERS-CoV (A), SARS-CoV (B) and 229E (C) unravel the molecular basis for the pan-CoV inhibitory effect of EK1 peptide.1st panel: Structural comparison of the HR1-EK1 6-HB bundles and cognate HR1-HR2 6-HB bundles reveals that the EK1 peptide binds to the 3HR1 core of different HCoVs in a similar manner to that of the native HR2 of corresponding HCoV. 2nd-4th panel: the extensive and highly-conserved hydrophobic and hydrophilic interactions between EK1 and different HR1s; EK1 residues that are involved in hydrophobic packing are shown as stick models on the electrostatic surfaces of 3HR1 cores(2nd panel), and HR1 residues from MERS-CoV, SARS-CoV and 229E that meditate highly conserved side chain–to-side chain (3rd panel) and side chain-to-main chain (4th panel) hydrophilic interactions with EK1 residues are boxed in cyan and redrespectively.