近日，上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院孫博課題組在學(xué)術(shù)期刊《核酸研究》(Nucleic Acids Research)發(fā)表了題為“CRISPR-AsCas12f1 couples out-of-protospacer DNA unwinding with exonuclease activity in the sequential target cleavage”（CRISPR-AsCas12f1結(jié)合原間隔外DNA的解旋以及外切酶活性實(shí)現(xiàn)對(duì)靶DNA的順序切割）的研究論文，揭示了緊湊型CRISPR核酸酶AsCas12f1的獨(dú)特核酸酶切割活性。

CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的用以對(duì)抗入侵病毒及外源DNA的免疫防御系統(tǒng)。II類(lèi)CRISPR系統(tǒng)中的Cas蛋白因其組成簡(jiǎn)單、成本低廉等特點(diǎn)，已被廣泛開(kāi)發(fā)成多種基因編輯工具。然而，較為常用的Cas9與Cas12a等CRISPR核酸酶通常具有較大的分子量（大于1,000個(gè)氨基酸），不利于體內(nèi)遞送，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。II類(lèi)V-F型CRISPR-Cas12f蛋白作為一類(lèi)新近發(fā)現(xiàn)的緊湊型Cas核酸酶（約400-700個(gè)氨基酸），較小的分子量極大方便了其作為基因編輯系統(tǒng)的體內(nèi)遞送。其中，來(lái)自細(xì)菌Acidibacillus sulfuroxidans中的AsCas12f1（422個(gè)氨基酸）對(duì)靶DNA的切割模式不同于其它Cas核酸酶，其準(zhǔn)確的分子機(jī)制仍不清楚。

該工作系統(tǒng)研究了AsCas12f1及其改進(jìn)型突變體對(duì)靶DNA切割過(guò)程的動(dòng)力學(xué)分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，AsCas12f1解旋原間隔區(qū)內(nèi)DNA后，在非靶鏈DNA上產(chǎn)生缺口（nick）并進(jìn)行雙向外切模式的核酸降解；隨后，AsCas12f1把DNA解旋范圍擴(kuò)展到原間隔區(qū)外的5-bp DNA，并對(duì)解旋的DNA進(jìn)行順序降解；最后，AsCas12f1在原間隔區(qū)下游3個(gè)核苷酸處內(nèi)切靶鏈DNA，并對(duì)PAM遠(yuǎn)端DNA進(jìn)行釋放，在靶DNA位置生成三處斷裂位點(diǎn)（圖1）。對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明Mg²⁺有助于原間隔內(nèi)、外DNA的解旋和降解之間的耦合，AsCas12f1-v5.1蛋白的突變加速了原間隔序列DNA的切割。綜上，該工作確定了AsCas12f1對(duì)靶DNA切割過(guò)程中的獨(dú)特雙向核酸外切酶活性，提供了完整的AsCas12f1催化DNA解旋偶聯(lián)核酸降解的動(dòng)態(tài)視圖，為基于Cas12f基因編輯工具的開(kāi)發(fā)、設(shè)計(jì)以及改進(jìn)提供了重要參考。

圖1：AsCas12f1催化DNA靶序列順序切割的分子機(jī)制模型。

上科大生命學(xué)院2023級(jí)博士生宋曉萱及2023屆博士畢業(yè)生陳紫婷為該論文的共同第一作者，孫博教授為通訊作者。上?？萍即髮W(xué)為第一完成單位。

文章鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkae989