近日，上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院陳佳團(tuán)隊(duì)在《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為“Leveraging base excision repair for efficient adenine base editing of mitochondrial DNA ”的研究論文，揭示了線(xiàn)粒體DNA腺嘌呤堿基編輯器TALEDs的工作機(jī)制，并研發(fā)出一系列增強(qiáng)型工具（eTALED6s），顯著提升了編輯效率與精準(zhǔn)度，為線(xiàn)粒體疾病治療提供了新工具。

線(xiàn)粒體作為細(xì)胞的“能量工廠(chǎng)”，在產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）中起著至關(guān)重要的作用。線(xiàn)粒體擁有自己獨(dú)立的DNA（線(xiàn)粒體DNA，mtDNA），它編碼線(xiàn)粒體功能所需的特定基因。與核DNA相比，由于在氧化磷酸化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，mtDNA更容易發(fā)生突變。其中大多數(shù)突變都是堿基替換，會(huì)導(dǎo)致各種線(xiàn)粒體遺傳性疾病，如Leber遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）、Leigh綜合征和線(xiàn)粒體腦肌病、乳酸酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作（MELAS）等。

在已知疾病相關(guān)的堿基替換中，超過(guò)40%是G-to-A/C-to-T突變，可通過(guò)A-to-G堿基編輯恢復(fù)。盡管基于CRISPR的堿基編輯系統(tǒng)已被廣泛用于核基因組DNA中，但由于引導(dǎo)RNA（gRNA）難以遞送至線(xiàn)粒體，尚未有效應(yīng)用于mtDNA中。近期，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）連接的脫氨酶（TALEDs）被報(bào)道，包括TALE陣列、雙鏈DNA（dsDNA）特異性胞苷脫氨酶（DddA）和單鏈DNA特異性腺苷脫氨酶（TadA8e）。與mtDNA中DddA介導(dǎo)的C-to-T編輯不同，TALEDs實(shí)現(xiàn)A-to-G編輯的詳細(xì)機(jī)制尚未完全清楚。

本研究構(gòu)建了多個(gè)BER相關(guān)基因的敲除細(xì)胞株，結(jié)合體外脫氨實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TALEDs并非直接在雙鏈DNA上進(jìn)行A-to-G編輯，而是依賴(lài)DddA誘導(dǎo)C-to-U的脫氨反應(yīng)，觸發(fā)線(xiàn)粒體堿基切除修復(fù)（BER）過(guò)程。TALED中的DddA首先介導(dǎo)了C-to-U的脫氨，體內(nèi)的尿嘧啶糖苷酶會(huì)進(jìn)一步切除所產(chǎn)生的尿嘧啶（U），形成堿基缺乏（AP）位點(diǎn)，含有AP位點(diǎn)的DNA單鏈被APE1催化切割或自發(fā)斷裂，產(chǎn)生DNA單鏈斷裂（SSB）。SSB被核酸外切酶hMGME1進(jìn)一步加工形成單鏈DNA（ssDNA），TALED中的TadA8e以ssDNA為底物介導(dǎo)A-to-I的脫氨反應(yīng)，并在隨后的修復(fù)過(guò)程中完成A-to-G的編輯（圖1）。

圖1：TALED工作機(jī)制示意圖

本研究利用BER開(kāi)發(fā)了一系列增強(qiáng)型TALEDs (eTALED6s)，顯著提高了TALEDs在靶向位點(diǎn)處的編輯效率。通過(guò)對(duì)腺嘌呤脫氨酶TadA8e進(jìn)行工程化改造，使得TALEDs在轉(zhuǎn)錄組水平上的脫靶突變顯著降低，同時(shí)還縮小了編輯窗口，減少了旁觀(guān)者效應(yīng)，顯著提高了編輯產(chǎn)物純度。研究還使用esTALED6和工程化的esTALED6R在線(xiàn)粒體基因組中模擬了與Leigh綜合征和MELAS相關(guān)的致病突變m.A13514G（圖2），通過(guò)測(cè)量氧耗率（OCR），證實(shí)eTALEDs成功誘導(dǎo)了預(yù)期的線(xiàn)粒體功能異常。

圖2：sTALED、esTALED6和esTALED6R和在線(xiàn)粒體基因組m.13514位點(diǎn)處介導(dǎo)的編輯效率（上），編輯產(chǎn)物純度（中）以及轉(zhuǎn)錄組脫靶數(shù)量（下）

這項(xiàng)研究不僅填補(bǔ)了TALED分子機(jī)制研究的空白，還在分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了一系列精準(zhǔn)、高效、低脫靶的新型線(xiàn)粒體腺嘌呤堿基編輯工具，使其在線(xiàn)粒體疾病模型構(gòu)建、遺傳修復(fù)和相關(guān)基礎(chǔ)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

上海科技大學(xué)陳佳教授為該論文通訊作者。上?？萍即髮W(xué)陳佳課題組博士研究生樊煜航、許文超，中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所博士研究生高寶青為該論文共同第一作者。上?？萍即髮W(xué)為論文的第一完成單位。該工作得到了復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院楊力研究員的大力支持。

論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41587-025-02608-w