果蠅（Drosophila melanogaster）作為重要模式生物之一，為基因功能研究、發(fā)育生物學(xué)、疾病模型構(gòu)建和藥物開(kāi)發(fā)提供了不可或缺的研究平臺(tái)。過(guò)去近20年間，依賴(lài)PhiC31整合酶的外源基因定點(diǎn)整合技術(shù)憑借更高的精確性，逐漸成為全球約3000個(gè)果蠅實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，PhiC31技術(shù)的局限性也日益顯現(xiàn)，如整合效率低、對(duì)基因大片段整合能力有限以及實(shí)驗(yàn)操作繁瑣等，不僅增加了實(shí)驗(yàn)成本和研究周期，還限制了研究效率。在面對(duì)全基因組規(guī)?；Y選和高通量研究的需求背景下，開(kāi)發(fā)更高效、更便捷的技術(shù)成為該領(lǐng)域的關(guān)鍵突破方向。

近日，上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院高冠軍課題組在《核酸研究》（Nucleic Acids Research, NAR）期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為“A powerful and highly efficient PAI-mediated transgenesis approach in Drosophila” 的研究論文。研究團(tuán)隊(duì)成功開(kāi)發(fā)出一種基于銅綠假單胞菌整合酶（Pseudomonas aeruginosa Integrase, PAI）的新型高效果蠅轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。研究顯示，該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因效率可達(dá)到PhiC31技術(shù)的近10倍，并成功克服了傳統(tǒng)方法整合效率低、基因大片段整合能力受限等方面的核心瓶頸。這一技術(shù)突破為果蠅遺傳學(xué)研究提供了更高效的工具。

通過(guò)對(duì)百萬(wàn)級(jí)微生物基因組的系統(tǒng)性生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)篩選驗(yàn)證，團(tuán)隊(duì)成功開(kāi)發(fā)了一種基于PAI新型整合酶介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。結(jié)果顯示，PAI系統(tǒng)在約 10 kb 基因大片段定點(diǎn)整合實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)基因成功率高達(dá)62%，較傳統(tǒng) PhiC31系統(tǒng)效率提升近10倍（一個(gè)數(shù)量級(jí)）。更重要的是，PAI系統(tǒng)能夠高效整合高達(dá)32 kb的外源基因大片段，而 PhiC31系統(tǒng)在整合15 kb以上片段時(shí)效率顯著下降甚至完全失敗。該突破為復(fù)雜基因組研究及超大基因片段的精準(zhǔn)整合提供了全新可能。

PAI整合酶的鑒定及PAI介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)

為進(jìn)一步提升PAI系統(tǒng)的應(yīng)用靈活性，團(tuán)隊(duì)還開(kāi)發(fā)了覆蓋果蠅三大染色體的多個(gè)靶位點(diǎn)菌株，包括常用的PAI-attP40（第2染色體）和PAI-attP2（第3染色體）。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，這些靶位點(diǎn)在15 kb基因大片段整合實(shí)驗(yàn)中效率卓越，與傳統(tǒng)PhiC31系統(tǒng)相比，PAI系統(tǒng)在整合效率方面優(yōu)勢(shì)明顯。這不僅為研究者提供了更多選擇，還顯著簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，為高通量研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。此外，PAI系統(tǒng)還展現(xiàn)出與前沿基因編輯技術(shù)的良好兼容性，它可無(wú)縫結(jié)合CRISPR等基因編輯工具，用于精準(zhǔn)操控基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此在器官發(fā)育調(diào)控及疾病模型構(gòu)建等領(lǐng)域，該系統(tǒng)有著強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。

總之，PAI系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)不僅極大提高了果蠅轉(zhuǎn)基因的效率，還為基因超大片段的精準(zhǔn)整合提供了前所未有的技術(shù)方案。這一突破將加速遺傳學(xué)研究進(jìn)程，在功能基因組學(xué)、疾病模型構(gòu)建和高通量篩選等領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)意義。為推動(dòng)該前沿技術(shù)的普及，研究團(tuán)隊(duì)免費(fèi)開(kāi)放PAI-attP 工具果蠅供全球?qū)W術(shù)研究使用。

高冠軍課題組碩士研究生史王飛、原副研究員張雪迪與博士研究生孫昂揚(yáng)為本論文共同第一作者。高冠軍和張雪迪為本文共同通訊作者。上海科技大學(xué)是該工作第一完成單位。

原文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkaf317