CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)憑借其高效性和便捷性，已在生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)育種及合成生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而，主流核酸酶Cas9和Cas12a因分子量過(guò)大（超過(guò)1000個(gè)氨基酸）而難以高效在體遞送，限制了其臨床應(yīng)用。2023年，上?？萍即髮W(xué)物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院季泉江團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)全新的超小型CRISPR-Cas12n系統(tǒng)（400-700個(gè)氨基酸），不僅能識(shí)別罕見(jiàn)的A富集PAM序列，還在細(xì)菌和人類(lèi)細(xì)胞中展現(xiàn)出高效編輯能力。團(tuán)隊(duì)表征了四種同源核酸酶（AcCas12n、RdCas12n、MlCas12n和CgCas12n），其中天然AcCas12n具備高編輯活性，經(jīng)過(guò)工程優(yōu)化后的Cas12Pro在大多數(shù)基因組位點(diǎn)的編輯效率已達(dá)到常規(guī)Cas9/Cas12a水平。

為深入理解這一系統(tǒng)的工作原理，季泉江團(tuán)隊(duì)成功解析了RdCas12n與sgRNA及目標(biāo)DNA形成的三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)，首次揭示其分子作用機(jī)制，研究成果以“Mechanisms and engineering of a miniature type V-N CRISPR-Cas12 effector enzyme”為題發(fā)表于《自然-通訊》（Nature Communications）。研究發(fā)現(xiàn)，RdCas12n以單體形式發(fā)揮作用，區(qū)別于另一類(lèi)常用的通過(guò)核酸酶二聚化發(fā)揮功能的超小型基因編輯系統(tǒng)CRISPR-Cas12f（圖1）。

圖1：RdCas12n復(fù)合體與AsCas12f1復(fù)合體的結(jié)構(gòu)比較

a. RdCas12n–sgRNA–dsDNA三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)。單個(gè)RdCas12n分子與引導(dǎo)RNA和目標(biāo)DNA共同形成效應(yīng)復(fù)合物，僅以單體形式發(fā)揮功能，PAM遠(yuǎn)端暴露于溶劑中。b. AsCas12f1–sgRNA–dsDNA三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)。兩個(gè)AsCas12f1分子協(xié)同與引導(dǎo)RNA和目標(biāo)DNA形成效應(yīng)復(fù)合物，通過(guò)二聚化將PAM遠(yuǎn)端包裹在B分子內(nèi)部。結(jié)構(gòu)圖中，dsDNA以灰色表示，PAM序列區(qū)域以紫色高亮；RNA以淺橙色表示，guide序列部分以紅色高亮。RdCas12n分子用藍(lán)色表示，NUC結(jié)構(gòu)域?yàn)锳F3預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。AsCas12f1的A分子用藍(lán)色表示，B分子用綠色表示。

研究還發(fā)現(xiàn)，RdCas12n的sgRNA呈現(xiàn)出多莖環(huán)結(jié)構(gòu)的同軸RNA螺旋，其穩(wěn)定構(gòu)象對(duì)酶的活性至關(guān)重要。與Cas12家族核酸酶以及祖先TnpB核酸酶的分子結(jié)構(gòu)對(duì)比表明，RdCas12n可能是V型CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)化的早期中間形態(tài)，這為探究其進(jìn)化路徑提供了關(guān)鍵證據(jù)。

基于結(jié)構(gòu)解析結(jié)果，研究人員對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計(jì)出高效sgRNA變體，顯著提升了人類(lèi)細(xì)胞的編輯活性。此外，團(tuán)隊(duì)通過(guò)移除RdCas12n的催化域（NUC），成功構(gòu)建了僅含270個(gè)氨基酸的超緊奏效應(yīng)器N-RdCas12n。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該精簡(jiǎn)版本仍能精確識(shí)別目標(biāo)DNA，并在細(xì)菌中展現(xiàn)出基因激活（CRISPRa）能力，為開(kāi)發(fā)更高效的遞送友好型基因編輯工具奠定了基礎(chǔ)（圖2）。

圖2：N-RdCas12n的工程改造與其CRISPRa應(yīng)用示意。
a. 展示了本研究中用于CRISPRa的dRdCas12n和超緊奏效應(yīng)器N-RdCas12n。b. 轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)流程示意：含有不同CRISPRa效應(yīng)子與報(bào)告基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入大腸桿菌S2060中，靶標(biāo)DNA結(jié)合后激活下游熒光素酶的表達(dá)。c. dRdCas12n與N-RdCas12n在9個(gè)不同靶點(diǎn)上的轉(zhuǎn)錄激活能力對(duì)比。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)（n=3）。

上?？萍即髮W(xué)季泉江課題組博士研究生傅文翰、馬佳誠(chéng)為共同第一作者，季泉江教授為通訊作者，上?？萍即髮W(xué)為第一完成單位。

論文標(biāo)題：Mechanisms and engineering of a miniature type V-N CRISPR-Cas12 effector enzyme

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-61290-3