9月10日，上海科技大學(xué)免疫化學(xué)研究所楊貝課題組與生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院陳佳課題組合作，在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Molecular Cell在線(xiàn)發(fā)表了題為“Structural insights into DdCBE in action enable high-precision mitochondrial DNA editing”的研究論文，通過(guò)解析處于工作狀態(tài)的線(xiàn)粒體胞嘧啶堿基編輯器DdCBE的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，開(kāi)發(fā)了可用于指導(dǎo)TALE識(shí)別區(qū)與spacer長(zhǎng)度設(shè)計(jì)的編輯窗口預(yù)測(cè)模型（WinPred）和高精度型DdCBE（aDdCBE），成功實(shí)現(xiàn)了單堿基精度的線(xiàn)粒體DNA編輯和對(duì)線(xiàn)粒體疾病的精準(zhǔn)模擬（圖1）。

圖1、研究摘要總結(jié)圖

線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）的突變會(huì)導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病，尤其危害能量需求高的組織和器官，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。例如，Leber遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）就可由線(xiàn)粒體中相關(guān)基因的點(diǎn)突變引起，患者常出現(xiàn)中心視力喪失。由于很多mtDNA突變是同質(zhì)性突變（即所有的mtDNA拷貝均攜帶同樣突變），可編程核酸酶進(jìn)行修正時(shí)會(huì)摧毀所有發(fā)生突變的線(xiàn)粒體基因組，造成災(zāi)難性后果。同時(shí)，由于引導(dǎo)RNA（gRNA）難以被遞送至線(xiàn)粒體，已廣泛用于核基因組精準(zhǔn)編輯的堿基編輯器等也無(wú)法有效應(yīng)用于mtDNA突變糾正。因此，為能精確糾正mtDNA中的致病性突變，科研人員開(kāi)發(fā)了新型的mtDNA堿基編輯技術(shù)—DdCBE及其系列衍生系統(tǒng)，通過(guò)偶聯(lián)效應(yīng)元件—雙鏈DNA胞苷脫氨酶DddA和一對(duì)可設(shè)計(jì)的定位元件—TALE陣列蛋白，可在兩組TALE陣列識(shí)別位點(diǎn)之間的spacer區(qū)域內(nèi)介導(dǎo)C到T堿基編輯。但這類(lèi)編輯器的“工作照片”尚未被捕獲，編輯窗口的決定因素有待闡釋?zhuān)庉嫶翱诘牟豢深A(yù)測(cè)性及脫靶效應(yīng)限制了這類(lèi)編輯器在基礎(chǔ)研究和線(xiàn)粒體疾病治療中的廣泛應(yīng)用。

針對(duì)上述難點(diǎn)，本工作首先解析了DdCBE分別靶向兩個(gè)內(nèi)源性線(xiàn)粒體基因位點(diǎn)的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，闡明了DdCBE的詳細(xì)工作機(jī)制及其編輯窗口的決定因素（圖2A），并建立了一個(gè)可預(yù)測(cè)不同長(zhǎng)度spacer內(nèi)任意位置編輯結(jié)果的工作模型WinPred（圖2B）。通過(guò)利用WinPred指導(dǎo)DdCBE中的TALE陣列蛋白識(shí)別位點(diǎn)與spacer長(zhǎng)度設(shè)計(jì)，聯(lián)合團(tuán)隊(duì)在不同線(xiàn)粒體基因位點(diǎn)處實(shí)現(xiàn)了高度精準(zhǔn)的高效編輯（圖2C）。此外還基于結(jié)構(gòu)信息對(duì)DdCBE中的效應(yīng)元件DddA進(jìn)行了工程化改造，獲得了高精準(zhǔn)線(xiàn)粒體堿基編輯器accurate DdCBE（aDdCBE），其編輯窗口僅 2~3 個(gè)堿基，同時(shí)其脫靶編輯接近于背景水平，更可與WinPred聯(lián)用實(shí)現(xiàn)單堿基高精準(zhǔn)堿基編輯（圖2D）。最后，本工作利用aDdCBE在線(xiàn)粒體DNA中精確引入了與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的致病突變，真實(shí)重現(xiàn)了與該突變相關(guān)的病理狀態(tài)，展示了WinPred與aDdCBE工具在線(xiàn)粒體疾病的精準(zhǔn)建模中的應(yīng)用潛力。

圖2、WinPred模型與aDdCBE編輯器的建立與應(yīng)用

注：A、sDdCBE的結(jié)構(gòu)模型揭示N-TALE到DddA-N和C-TALE到DddA-C的溶液可及表面距離（distance- N和 distance-C）是編輯窗口的決定因素：B、WinPred模型預(yù)測(cè)的不同長(zhǎng)度spacer中的編輯窗口（橘黃色區(qū)域）；C、應(yīng)用WinPred模型指導(dǎo)TALE陣列蛋白識(shí)別位點(diǎn)（藍(lán)色與紫色框）與spacer長(zhǎng)度重設(shè)計(jì)（R02-sDdCBE11），成功去除了旁觀(guān)者編輯（紅色箭頭），實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)（綠色箭頭）的高效編輯；D、通過(guò)WinPred模型指導(dǎo)sDdCBE設(shè)計(jì)并聯(lián)用aDdCBE（L02-aDdCBE_V3），在MTTK位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)（綠色箭頭）的單堿基編輯。

該研究首次從結(jié)構(gòu)角度揭示了DdCBE的詳細(xì)工作機(jī)制，加深了領(lǐng)域內(nèi)對(duì)DdCBE編輯窗口發(fā)生規(guī)律的理解，研究成果為后續(xù)的線(xiàn)粒體堿基編輯器優(yōu)化和開(kāi)發(fā)提供了重要的理論參考。而研究中開(kāi)發(fā)的WinPred模型和aDdCBE編輯器也為線(xiàn)粒體疾病的精準(zhǔn)建模和治療提供了可供應(yīng)用的新方法、新策略。

上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所楊貝課題組博士畢業(yè)生項(xiàng)江超、上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院陳佳課題組博士研究生許文超和高級(jí)工程師吳晶為論文共同第一作者。上海科技大學(xué)楊貝教授與陳佳教授為該論文的通訊作者。上?？萍即髮W(xué)為論文的第一完成單位。

論文鏈接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(25)00701-4