細(xì)菌與噬菌體之間的共同演化通常表現(xiàn)為激烈的“軍備競(jìng)賽”。例如，細(xì)菌通過(guò)CRISPR-Cas系統(tǒng)來(lái)抵御外來(lái)噬菌體入侵，而噬菌體則利用Anti-CRISPR蛋白來(lái)抑制這種免疫反應(yīng)（圖1）。那么在這場(chǎng)攻防博弈中，噬菌體是否會(huì)裝備CRISPR-Cas系統(tǒng)，并“反向利用”細(xì)菌體內(nèi)蛋白進(jìn)行功能激活呢？這一可能性此前鮮有報(bào)道，機(jī)制亦不明確。

近日，上?？萍即髮W(xué)物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院季泉江課題組在《自然-微生物學(xué)》（Nature Microbiology）發(fā)表了題為“Phage-associated Cas12p nucleases require binding to bacterial thioredoxin for activation and cleavage of target DNA”的研究論文，發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)噬菌體來(lái)源的新型超小型Cas12核酸酶——Cas12p（500-700個(gè)氨基酸），并揭示了其通過(guò)“劫持”細(xì)菌體內(nèi)的硫氧還蛋白（TrxA）來(lái)激活自身DNA切割活性的獨(dú)特分子機(jī)制（圖1）。

圖1：Anti-CRISPR（左）與CRISPR activation（右）機(jī)制示意圖

近年來(lái)，多種V型CRISPR-Cas12系統(tǒng)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和表征，它們?cè)诘鞍捉Y(jié)構(gòu)、核酸靶向機(jī)制及生物學(xué)功能等方面呈現(xiàn)出豐富的多樣性。研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)自然界中仍蘊(yùn)藏著大量未知變體，并據(jù)此建立了一套高效的V型CRISPR-Cas系統(tǒng)挖掘流程，從宏基因組數(shù)據(jù)中篩選出多種未被報(bào)道的候選Cas12蛋白（圖2）。AlphaFold結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，Cas12p的識(shí)別（Recognition，REC）結(jié)構(gòu)域存在一處內(nèi)部無(wú)序區(qū)域，這一特征暗示其可能具備特殊功能。進(jìn)化分析表明，Cas12p可能是轉(zhuǎn)座相關(guān)蛋白TnpB向Cas12核酸酶進(jìn)化的早期中間體。

圖2：CRISPR-Cas12系統(tǒng)的挖掘

a. 新型CRISPR-Cas12系統(tǒng)的生物信息學(xué)挖掘流程。b. 候選Cas12蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。 c. 微型CRISPR-Cas12系統(tǒng)的基因座結(jié)構(gòu)。d. 不同Cas12蛋白的長(zhǎng)度。e. TnpB蛋白與其他微型Cas12變體之間的進(jìn)化關(guān)系樹(shù)。

為了闡明Cas12p的作用機(jī)理，研究利用冷凍電鏡技術(shù)解析了Cas12p復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)（圖3），表明Cas12p與一個(gè)細(xì)菌內(nèi)源性蛋白存在緊密的相互作用。生化實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析進(jìn)一步確證了TrxA是Cas12p的特異性結(jié)合伴侶。

機(jī)制研究闡明了TrxA激活Cas12p的分子基礎(chǔ)：Cas12p利用其獨(dú)特的TrxA結(jié)合（TrxA binding，TB）結(jié)構(gòu)域，主要通過(guò)疏水相互作用與TrxA形成穩(wěn)定的異源二聚體（圖3）。TrxA的結(jié)合誘導(dǎo)了Cas12p發(fā)生變構(gòu)，將原本靈活的TB.b環(huán)鎖定在特定構(gòu)象。這種空間上的精準(zhǔn)限位使得TB.b環(huán)能通過(guò)靜電相互作用識(shí)別sgRNA-DNA雜合雙鏈，進(jìn)而激活核酸酶的底物切割活性。細(xì)菌遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，敲除trxA基因會(huì)導(dǎo)致Cas12p喪失基因組干擾能力，而回補(bǔ)trxA則能完全恢復(fù)其活性（圖3）。這一系列證據(jù)證實(shí)，TrxA是Cas12p發(fā)揮功能所必需的“激活開(kāi)關(guān)”。

圖3：TrxA激活Cas12p的分子機(jī)制

a. Cas12p 復(fù)合物冷凍電鏡密度圖。b. Cas12p與TrxA相互作用的生化驗(yàn)證。c. Cas12p-TrxA-sgRNA-dsDNA復(fù)合物的原子模型。d. Cas12p的TB結(jié)構(gòu)域與TrxA的結(jié)合界面。e. Cas12p的TB結(jié)構(gòu)域與sgRNA-DNA雜合雙鏈之間的相互作用。f. trxA激活Cas12p的遺傳回補(bǔ)驗(yàn)證。

Cas12p作為一種超小型核酸酶，其緊湊的尺寸降低了基因治療的遞送門(mén)檻。本研究揭示的“宿主因子輔助激活”機(jī)制為基因編輯工具的效率優(yōu)化與活性調(diào)控提供了新方向：通過(guò)引入特定輔助因子和改造相關(guān)結(jié)構(gòu)域，研究人員不僅有望提升其他超小型Cas蛋白的活性，還能利用對(duì)輔助因子的依賴(lài)性構(gòu)建“分子開(kāi)關(guān)”，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因編輯的精準(zhǔn)調(diào)控，從而開(kāi)發(fā)兼具高活性與高安全性的基因編輯系統(tǒng)。

上?？萍即髮W(xué)物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院季泉江課題組博士后王志鵬和王玉玨為該論文的共同第一作者，季泉江教授為通訊作者，上?？萍即髮W(xué)為第一完成單位。

論文標(biāo)題：Phage-associated Cas12p nucleases require binding to bacterial thioredoxin for activation and cleavage of target DNA

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41564-025-02224-z